dopředný rozptyl vs. boční rozptyl

průtoková cytometrie je metoda jednobuněčné analýzy, která zahrnuje charakterizaci fyzikálních vlastností buňky. V průtokovém cytometru je buněčná populace suspendována v čirém fyziologickém roztoku. Suspenze je vedena tryskou, která vytváří jednobuněčný proud. Populace pak proudí kolem sady laserových světelných zdrojů po jedné buňce. Zatímco je vyslýchán lasery, buňka rozptyluje světlo (1). Obrázek 1 poskytuje přehled schématu průtokového cytometru.

Optická Soustava.PNG

Obrázek 1. Schéma optiky průtokového cytometru (2).

poměr mezi velikostí buňky a vlnovou délkou laseru mění chování rozptylu. Pokud je velikost buňky menší než excitace dotazovacího laseru, chování rozptylu je nekonzistentní a má nízkou intenzitu. V souladu s tím laser obvykle vydává světlo při vlnové délce kratší než dotazované částice. Vlnová délka 488 nebo 405 nm je běžná (1).

rozptyl světla se měří dvěma optickými detektory. Jeden detektor měří rozptyl podél dráhy laseru (1). Tento parametr se označuje jako dopředný rozptyl (FSC). Druhý detektor měří rozptyl v úhlu devadesáti stupňů vzhledem k laseru (1). Tento parametr se nazývá side scatter (SSC). Při měření ve spojení, tato dvě měření umožňují určitý stupeň buněčné diferenciace v heterogenní populaci.

měření dopředného rozptylu umožňuje diskriminaci buněk podle velikosti. Intenzita FSC je úměrná průměru buňky a je primárně způsobena difrakcí světla kolem buňky. Dopředný rozptyl je detekován fotodiodou, která převádí světlo na elektrický signál. Intenzita vyrobeného napětí je úměrná průměru dotazovaného článku (1).

FSC je užitečné pro rozlišení mezi buňkami imunitního systému. Monocyty a lymfocyty jsou dvě třídy bílých krvinek. Obecně jsou monocyty větší než lymfocyty a vykazují dopředný rozptyl vyšší intenzity.

Obrázek 2. Diskriminace lymfocytů a monocytů ve FlowJo™ na základě parametrů rozptylu. Poznámka: Tento příklad je pouze ilustrační, ilustrované populace buď nejsou skutečné buňky monocytů / lymfocytů, nebo pacient vykazuje akutní monocytózu.

měření bočního rozptylu poskytuje informace o vnitřní složitosti (tj. Rozhraní mezi laserem a intracelulárními strukturami způsobuje, že se světlo lomí nebo odráží. Buněčné složky, které zvyšují boční rozptyl, zahrnují granule a jádro (1).

vzhledem k dopřednému rozptylu jsou světelné signály z bočního rozptylu slabé. Fotonásobičová trubice (PMT) se používá k měření bočního rozptylu, protože se jedná o citlivější optický detektor (1).

boční rozptyl je užitečný pro identifikaci buněk s různou složitostí. Například monocyty a granulocyty. Granulocyty se vyznačují vysokým objemem cytoplazmatických granulí. Odraz světla od granulí zvyšuje intenzitu měření SSC a umožňuje rozlišení mezi granulocyty a monocyty (1).

obrázek 3. Diskriminace granulocytů a monocytů ve FlowJo na základě parametrů rozptylu.

pro každý signál (tj. elektromagnetický impuls), který prochází do detektoru (PMT nebo fotodioda), lze zaznamenat tři charakteristiky: výšku, šířku a plochu. Zatímco oblast pulsu je nejčastěji hlášena, každý má odlišné výhody a nevýhody. V rámci parametrů rozptylu se grafy výšky pulsu versus šířky pulsu používají k izolaci jednotlivých buněk procházejících cytometrem, a tím k odstranění všech nesamostatných buněk (dublety, shluky nebo zbytky).

obrázek 4. Rozlišování jednotlivých buněk z výšky rozptylu oproti parametrům šířky rozptylu v FlowJo™.

průtokový cytometr měří FSC a SSC současně a tyto dva parametry dohromady poskytují poměrně dobrý základ pro zahájení analýzy buněčné populace. Existují další metody kvantifikace buněk,ale existuje velké množství informací, které lze získat z rozptylových dat.

  1. Shapiro, Howarde. Praktická Průtoková Cytometrie. New York, Alan R. Liss, 1985.

  2. Schematický přehled typického nastavení průtokového cytometru. 2016, SelectScience.

Napsat komentář

Vaše e-mailová adresa nebude zveřejněna.