Vorwärtsstreuung vs. Seitenstreuung

Die Durchflusszytometrie ist eine Methode der Einzelzellanalyse, die die Charakterisierung der physikalischen Eigenschaften einer Zelle umfasst. In einem Durchflusszytometer wird eine Zellpopulation in einer klaren Salzlösung suspendiert. Die Suspension wird durch eine Düse geleitet, die einen einzelligen Strom bildet. Die Population fließt dann zellweise an einer Reihe von Laserlichtquellen vorbei. Während der Abfrage durch die Laser streut die Zelle Licht (1). Abbildung 1 bietet einen Überblick über ein Durchflusszytometer-Schema.

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Abbildung 1. Schematische Darstellung der Durchflusszytometeroptik (2).

Das Verhältnis zwischen Zellgröße und Laserwellenlänge verändert das Streuverhalten. Wenn die Zellgröße kleiner als die Anregung des abfragenden Lasers ist, ist das Streuverhalten inkonsistent und von geringer Intensität. Dementsprechend emittiert der Laser normalerweise Licht mit einer Wellenlänge, die kürzer ist als die abgefragten Partikel. Eine Wellenlänge von 488 oder 405 nm ist üblich (1).

Die Lichtstreuung wird mit zwei optischen Detektoren gemessen. Ein Detektor misst Streuung entlang der Bahn des Lasers (1). Dieser Parameter wird als Forward Scatter (FSC) bezeichnet. Der andere Detektor misst die Streuung in einem Winkel von neunzig Grad relativ zum Laser (1). Dieser Parameter wird als Side Scatter (SSC) bezeichnet. Wenn sie in Verbindung gemessen werden, ermöglichen diese beiden Messungen einen gewissen Grad an Zelldifferenzierung innerhalb einer heterogenen Population.

Die Messung der Vorwärtsstreuung ermöglicht die Unterscheidung von Zellen nach Größe. Die FSC-Intensität ist proportional zum Durchmesser der Zelle und beruht hauptsächlich auf der Lichtbeugung um die Zelle herum. Die Vorwärtsstreuung wird von einer Fotodiode erfasst, die das Licht in ein elektrisches Signal umwandelt. Die Intensität der erzeugten Spannung ist proportional zum Durchmesser der abgefragten Zelle (1).

FSC ist hilfreich für die Unterscheidung zwischen Zellen des Immunsystems. Monozyten und Lymphozyten sind zwei Klassen von weißen Blutkörperchen. Im Allgemeinen sind Monozyten größer als Lymphozyten und zeigen eine höhere Intensität der Vorwärtsstreuung.

Abbildung 2. Unterscheidung von Lymphozyten und Monozyten in FlowJo™ anhand von Streuparametern. Beachten: Dieses Beispiel dient nur zur Veranschaulichung, die dargestellten Populationen sind entweder keine tatsächlichen Monozyten- / Lymphozytenzellen oder der Patient zeigt eine akute Monozytose.

Die Seitenstreuungsmessung liefert Informationen über die interne Komplexität (d. h. Granularität) einer Zelle. Die Schnittstelle zwischen dem Laser und intrazellulären Strukturen bewirkt, dass das Licht zu brechen oder zu reflektieren. Zelluläre Komponenten, die die Seitenstreuung erhöhen, umfassen Granulate und den Kern (1).

Relativ zur Vorwärtsstreuung sind die Lichtsignale von der Seitenstreuung schwach. Eine Photomultiplier-Röhre (PMT) wird zur Messung der Seitenstreuung verwendet, da sie ein empfindlicherer optischer Detektor ist (1).

Seitenstreuung ist hilfreich für die Identifizierung von Zellen mit unterschiedlicher Komplexität. Zum Beispiel Monozyten und Granulozyten. Granulozyten zeichnen sich durch das hohe Volumen an zytoplasmatischen Granula aus. Die Lichtreflexion an den Granula erhöht die Intensität der SSC-Messung und ermöglicht eine Unterscheidung zwischen Granulozyten und Monozyten (1).

Abbildung 3. Unterscheidung von Granulozyten und Monozyten im Durchfluss anhand von Streuparametern.

Für jedes Signal (d. h. elektromagnetischer Impuls), das in einen Detektor (PMT oder Photodiode) gelangt, können drei Eigenschaften aufgezeichnet werden: Höhe, Breite und Fläche. Während der Pulsbereich am häufigsten angegeben wird, gibt es jeweils unterschiedliche Vor- und Nachteile. Innerhalb der Streuungsparameter werden die Pulshöhen- und Pulsbreitendiagramme verwendet, um einzelne Zellen zu isolieren, die das Zytometer passieren, und dadurch nicht einzelne Zellen (Dubletten, Klumpen oder Trümmer) zu entfernen.

Abbildung 4. Unterscheidung einzelner Zellen von Streuhöhen- und Streubreitenparametern in FlowJo ™.

Ein Durchflusszytometer misst FSC und SSC gleichzeitig, und die beiden Parameter zusammen bieten eine ziemlich gute Grundlage, um mit der Analyse einer Zellpopulation zu beginnen. Es gibt weitere Methoden der Zellquantifizierung, aber es gibt viele Informationen, die aus Streudaten gewonnen werden können.

  1. Shapiro, Howard. Praktische Durchflusszytometrie. New York, Alan R. Liss, 1985.

  2. Schematische Übersicht eines typischen Durchflusszytometeraufbaus. 2016, SelectScience.

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