Dispersión directa vs Dispersión Lateral

La citometría de flujo es un método de análisis unicelular que incluye la caracterización de las propiedades físicas de una célula. En un citómetro de flujo, se suspende una población celular en una solución salina transparente. La suspensión se canaliza a través de una boquilla que forja una corriente unicelular. La población pasa luego por un conjunto de fuentes de luz láser, una célula a la vez. Al ser interrogada por los láseres, la célula dispersa la luz (1). La Figura 1 proporciona una visión general del esquema de un citómetro de flujo.

 Sistema óptico.PNG

Figura 1. Esquema óptico del citómetro de flujo (2).

La relación entre el tamaño de la celda y la longitud de onda del láser altera el comportamiento de dispersión. Cuando el tamaño de la celda es menor que la excitación del láser interrogador, el comportamiento de dispersión es inconsistente y de baja intensidad. En consecuencia, el láser generalmente emite luz a una longitud de onda más corta que las partículas interrogadas. Una longitud de onda de 488 o 405 nm es común (1).

La dispersión de luz se mide mediante dos detectores ópticos. Un detector mide la dispersión a lo largo de la trayectoria del láser (1). Este parámetro se conoce como dispersión frontal (FSC). El otro detector mide la dispersión en un ángulo de noventa grados con respecto al láser (1). Este parámetro se denomina dispersión lateral (SSC). Cuando se miden en conjunción, estas dos mediciones permiten cierto grado de diferenciación celular dentro de una población heterogénea.

La medición de la dispersión hacia adelante permite la discriminación de las células por tamaño. La intensidad del FSC es proporcional al diámetro de la célula, y se debe principalmente a la difracción de luz alrededor de la célula. La dispersión hacia adelante es detectada por un fotodiodo, que convierte la luz en una señal eléctrica. La intensidad de la tensión producida es proporcional al diámetro de la celda interrogada (1).

El FSC es útil para distinguir entre células del sistema inmunitario. Los monocitos y los linfocitos son dos clases de glóbulos blancos. En general, los monocitos son más grandes que los linfocitos y exhiben una dispersión hacia adelante de mayor intensidad.

Figura 2. Discriminación de linfocitos y monocitos en FlowJo™ basada en parámetros de dispersión. Nota: Este ejemplo es solo para fines ilustrativos, las poblaciones ilustradas no son células monocitos/linfocitos reales, o el paciente presenta monocitosis aguda.

La medición de dispersión lateral proporciona información sobre la complejidad interna (es decir, granularidad) de una celda. La interfaz entre el láser y las estructuras intracelulares hace que la luz se refracte o se refleje. Los componentes celulares que aumentan la dispersión lateral incluyen los gránulos y el núcleo (1).

En relación con la dispersión hacia adelante, las señales de luz de la dispersión lateral son débiles. Se utiliza un tubo fotomultiplicador (PMT) para medir la dispersión lateral porque es un detector óptico más sensible (1).

La dispersión lateral es útil para la identificación de celdas con complejidad variable. Por ejemplo, monocitos y granulocitos. Los granulocitos se caracterizan por el alto volumen de gránulos citoplásmicos. El reflejo de la luz de los gránulos aumenta la intensidad de la medición de SSC y permite el discernimiento entre granulocitos y monocitos (1).

Figura 3. Discriminación de granulocitos y monocitos en FlowJo basada en parámetros de dispersión.

Para cada señal (es decir, pulso electromagnético) que pasa a un detector (PMT o fotodiodo) se pueden registrar tres características: Altura, anchura y superficie. Si bien el área de pulso se informa con mayor frecuencia, hay ventajas y desventajas distintivas para cada uno. Dentro de los parámetros de dispersión, las gráficas de altura de pulso frente a ancho de pulso se utilizan para aislar células individuales que pasan por el citómetro y, por lo tanto, eliminar cualquier célula no individual (dobletes, grumos o residuos).

Figura 4. Discriminar celdas individuales entre los parámetros de altura de dispersión y ancho de dispersión en FlowJo™.

Un citómetro de flujo mide FSC y SSC simultáneamente, y los dos parámetros combinados proporcionan una base bastante buena para comenzar el análisis de una población celular. Hay otros métodos de cuantificación celular, pero hay una gran cantidad de información que se puede obtener de los datos de dispersión.

  1. Shapiro, Howard. Citometría de Flujo Práctica. Nueva York, Alan R. Liss, 1985.

  2. Descripción esquemática de una configuración típica del citómetro de flujo. 2016, Seleccione Ciencia.

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