Diffusion avant vs Diffusion latérale

La cytométrie en flux est une méthode d’analyse unicellulaire qui comprend la caractérisation des propriétés physiques d’une cellule. Dans un cytomètre en flux, une population cellulaire est suspendue dans une solution saline claire. La suspension est canalisée à travers une buse qui forge un flux monocellulaire. La population passe ensuite devant un ensemble de sources de lumière laser, une cellule à la fois. En étant interrogée par les lasers, la cellule diffuse la lumière (1). La figure 1 donne un aperçu du schéma d’un cytomètre en flux.

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Figure 1. Schéma optique du cytomètre en flux (2).

Le rapport entre la taille des cellules et la longueur d’onde du laser modifie le comportement de diffusion. Lorsque la taille de la cellule est inférieure à l’excitation du laser interrogateur, le comportement de diffusion est incohérent et de faible intensité. En conséquence, le laser émet généralement de la lumière à une longueur d’onde plus courte que les particules interrogées. Une longueur d’onde de 488 ou 405 nm est courante (1).

La diffusion de la lumière est mesurée par deux détecteurs optiques. Un détecteur mesure la diffusion le long du trajet du laser (1). Ce paramètre est appelé dispersion directe (FSC). L’autre détecteur mesure la diffusion à un angle de quatre-vingt-dix degrés par rapport au laser (1). Ce paramètre est appelé dispersion latérale (SSC). Lorsqu’elles sont mesurées conjointement, ces deux mesures permettent un certain degré de différenciation cellulaire au sein d’une population hétérogène.

La mesure de la diffusion vers l’avant permet la discrimination des cellules en fonction de leur taille. L’intensité du FSC est proportionnelle au diamètre de la cellule et est principalement due à la diffraction de la lumière autour de la cellule. La diffusion directe est détectée par une photodiode, qui convertit la lumière en un signal électrique. L’intensité de la tension produite est proportionnelle au diamètre de la cellule interrogée (1).

Le FSC est utile pour distinguer les cellules du système immunitaire. Les monocytes et les lymphocytes sont deux classes de globules blancs. En général, les monocytes sont plus gros que les lymphocytes et présentent une dispersion vers l’avant d’une intensité plus élevée.

Figure 2. Discrimination des lymphocytes et des monocytes dans FlowJo™ en fonction des paramètres de diffusion. Note: Cet exemple est à titre d’illustration seulement, les populations illustrées ne sont pas des cellules monocytaires/ lymphocytaires réelles, ou le patient présente une monocytose aiguë.

La mesure de dispersion latérale fournit des informations sur la complexité interne (c’est-à-dire la granularité) d’une cellule. L’interface entre le laser et les structures intracellulaires provoque la réfraction ou la réflexion de la lumière. Les composants cellulaires qui augmentent la dispersion latérale comprennent les granules et le noyau (1).

Par rapport à la diffusion directe, les signaux lumineux de la diffusion latérale sont faibles. Un tube photomultiplicateur (PMT) est utilisé pour mesurer la diffusion latérale car il s’agit d’un détecteur optique plus sensible (1).

La dispersion latérale est utile pour l’identification de cellules de complexité variable. Par exemple, les monocytes et les granulocytes. Les granulocytes sont caractérisés par le volume élevé de granules cytoplasmiques. La réflexion de la lumière sur les granules augmente l’intensité de la mesure SSC et permet un discernement entre granulocytes et monocytes (1).

Figure 3. Discrimination des granulocytes et des monocytes dans FlowJo en fonction des paramètres de diffusion.

Pour chaque signal (i.e. impulsion électromagnétique) qui passe dans un détecteur (PMT ou photodiode), trois caractéristiques peuvent être enregistrées: Hauteur, largeur et surface. Bien que la zone du pouls soit le plus souvent signalée, chacun présente des avantages et des inconvénients distincts. Dans les paramètres de diffusion, les diagrammes de hauteur d’impulsion par rapport à la largeur d’impulsion sont utilisés pour isoler des cellules uniques traversant le cytomètre et éliminer ainsi toutes les cellules non uniques (doublets, amas ou débris).

Figure 4. Discriminer les cellules individuelles des paramètres de hauteur de diffusion par rapport à la largeur de diffusion dans FlowJo ™.

Un cytomètre en flux mesure simultanément le FSC et le SSC, et les deux paramètres combinés fournissent une base assez bonne pour commencer l’analyse d’une population cellulaire. Il existe d’autres méthodes de quantification cellulaire, mais de nombreuses informations peuvent être obtenues à partir des données de dispersion.

  1. Il s’agit d’un homme. Cytométrie En flux pratique. New York, Alan R. Liss, 1985.

  2. Aperçu schématique d’une configuration de cytomètre en flux typique. 2016, SelectScience.

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