Forward Scatter vs Side Scatter

Flowcytometri er en metode for enkeltcelleanalyse som inkluderer karakterisering av cellens fysiske egenskaper. I et flowcytometer suspenderes en cellepopulasjon i en klar saltoppløsning. Suspensjonen trekkes gjennom en dyse som smelter en enkeltcellestrøm. Befolkningen flyter deretter forbi et sett med laserlyskilder en celle om gangen. Mens du blir forhørt av lasere, sprer cellen lys (1). Figur 1 gir en oversikt over et flowcytometer skjematisk.

 Optikksystem.PNG

Figur 1. Flowcytometer optikk skjematisk (2).

forholdet mellom cellestørrelse og laserbølgelengde endrer scatter-atferd. Når cellestørrelsen er mindre enn eksitasjonen av forhørslaseren, er scatter-oppførselen inkonsekvent og lav intensitet. Følgelig sender laseren vanligvis lys ved en bølgelengde kortere enn forhørte partikler. En bølgelengde på 488 eller 405 nm er vanlig (1).

lysspredningen måles av to optiske detektorer. En detektor måler scatter langs banen til laseren (1). Denne parameteren kalles forward scatter (fsc). Den andre detektoren måler scatter i en nitti graders vinkel i forhold til laseren (1). Denne parameteren kalles side scatter (SSC). Når de måles i sammenheng, tillater disse to målingene en viss grad av cellulær differensiering innenfor en heterogen populasjon.

måling av fremover scatter tillater diskriminering av celler etter størrelse. FSC intensitet er proporsjonal med diameteren av cellen, og er hovedsakelig på grunn av lys diffraksjon rundt cellen. Forward scatter oppdages av en fotodiode, som konverterer lyset til et elektrisk signal. Intensiteten til den produserte spenningen er proporsjonal med diameteren til den forhørte cellen (1).

FSC er nyttig for å skille mellom celler i immunsystemet. Monocytter og lymfocytter er to klasser av hvite blodlegemer. Generelt er monocytter større enn lymfocytter og utviser spredning av høyere intensitet.

Figur 2. Diskriminering av lymfocytter og monocytter i FlowJo™ basert på spredningsparametere. Merk: Dette eksemplet er kun for illustrasjonsformål, populasjonene som er illustrert er enten ikke faktiske monocytt / lymfocyttceller, eller pasienten viser akutt monocytose.

sidespredningsmåling gir informasjon om den interne kompleksiteten (dvs. granularitet) av en celle. Grensesnittet mellom laser og intracellulære strukturer får lyset til å bryte eller reflektere. Cellulære komponenter som øker sidespredning inkluderer granulater og kjernen (1).

I Forhold til fremover scatter, lyssignaler fra side scatter er svake. Et fotomultiplikatorrør (PMT) brukes til å måle sidespredning fordi det er en mer sensitiv optisk detektor (1).

Side scatter er nyttig for identifisering av celler med varierende kompleksitet. For eksempel monocytter og granulocytter. Granulocytter er preget av det høye volumet av cytoplasmatiske granulater. Lysrefleksjonen av granulatene øker INTENSITETEN AV SSC-målingen og gjør det mulig å skille mellom granulocytter og monocytter (1).

Figur 3. Diskriminering av granulocytter og monocytter i FlowJo basert på scatter parametere.

for hvert signal (dvs. elektromagnetisk puls) som passerer inn i en detektor (PMT eller fotodiode) er det tre egenskaper som kan registreres: Høyde, bredde og areal. Mens pulsområdet er mest rapportert, er det forskjellige fordeler og ulemper for hver. Innenfor spredningsparametere brukes pulshøyden versus pulsbreddeplottene til å isolere enkeltceller som passerer gjennom cytometeret, og dermed fjerne eventuelle ikke-enkeltceller (dubletter, klumper eller rusk).

Figur 4. Diskriminerende enkeltceller fra scatter høyde versus scatter bredde parametere I FlowJo™.

et flowcytometer måler FSC og SSC samtidig, og de to parametrene kombinert gir et ganske godt grunnlag for å begynne analyse av en cellepopulasjon. Det finnes flere metoder for cellekvantifisering, men det er mye informasjon som kan hentes fra scatter-data.

  1. Shapiro, Howard. Praktisk Flowcytometri. New York, Alan R. Liss, 1985.

  2. Skjematisk oversikt over et typisk flowcytometer-oppsett. 2016, SelectScience.

Legg igjen en kommentar

Din e-postadresse vil ikke bli publisert.