Forward Scatter Versus Side Scatter

flowcytometrie is een methode voor eencellige analyse waarbij de fysische eigenschappen van een cel worden gekarakteriseerd. In een stroomcytometer, wordt een celbevolking opgeschort in een duidelijke zoutoplossing. De suspensie wordt door een mondstuk geleid dat een eencellige stroom smeedt. De bevolking stroomt dan langs een reeks laserlichtbronnen één cel tegelijk. Tijdens het verhoor door de lasers verstrooit de cel licht (1). Figuur 1 geeft een overzicht van een schema van de stroomcytometer.

Optisch Systeem.PNG

figuur 1. Flow cytometer optiek schema (2).

de verhouding tussen celgrootte en lasergolflengte verandert het verstrooiingsgedrag. Wanneer de celgrootte kleiner is dan de opwinding van de ondervragende laser, is het verstrooiingsgedrag inconsistent en laag-intensiteit. Dienovereenkomstig, straalt de laser gewoonlijk licht uit bij een golflengte korter dan ondervraagde deeltjes. Een golflengte van 488 of 405 nm is gebruikelijk (1).

de lichtverstrooiing wordt gemeten door twee optische detectoren. Eén detector meet de verstrooiing langs het pad van de laser (1). Deze parameter wordt aangeduid als forward scatter (FSC). De andere detector meet de verstrooiing onder een hoek van negentig graden ten opzichte van de laser (1). Deze parameter wordt side scatter (SSC) genoemd. Wanneer samen gemeten, staan deze twee metingen voor enige graad van cellulaire differentiatie binnen een heterogene bevolking toe.

de meting van forward scatter maakt onderscheid tussen cellen naar grootte mogelijk. De intensiteit van FSC is evenredig aan de diameter van de cel, en is hoofdzakelijk toe te schrijven aan lichte diffractie rond de cel. Voorwaartse verstrooiing wordt gedetecteerd door een fotodiode, die het licht omzet in een elektrisch signaal. De intensiteit van de geproduceerde spanning is evenredig met de diameter van de ondervraagde cel (1).

FSC is nuttig voor het onderscheiden van cellen van het immuunsysteem. Monocyten en lymfocyten zijn twee klassen van witte bloedcellen. In het algemeen, zijn monocytes groter dan lymfocyten en vertonen voorwaartse verspreiding van een hogere intensiteit.

Figuur 2. Discriminatie van lymfocyten en monocyten in FlowJo™ op basis van verstrooiingsparameters. Opmerking: Dit voorbeeld is slechts ter illustratie doeleinden, de geà llustreerde populaties zijn of geen daadwerkelijke monocyt / lymfocyt cellen, of de patiënt vertoont scherpe monocytose.

Zijverstrooiing geeft informatie over de interne complexiteit (d.w.z. granulariteit) van een cel. De interface tussen de laser en intracellular structuren veroorzaakt het licht om te breken of te reflecteren. Cellulaire componenten die zijverstrooiing verhogen omvatten korrels en de kern (1).

ten opzichte van forward scatter zijn lichtsignalen van side scatter zwak. Een fotomultiplicatorbuis (PMT) wordt gebruikt om zijverstrooiing te meten omdat het een gevoeliger optische detector is (1).

Zijverstrooiing is nuttig voor de identificatie van cellen met verschillende complexiteit. Bijvoorbeeld monocyten en granulocyten. Granulocyten worden gekenmerkt door het hoge volume van cytoplasmatische korrels. De lichtreflectie van de korrels verhoogt de intensiteit van de SSC-meting en maakt onderscheid tussen granulocyten en monocyten (1) mogelijk.

Figuur 3. Discriminatie van granulocyten en monocyten in FlowJo op basis van verstrooiingsparameters.

voor elk signaal (d.w.z. elektromagnetische puls) dat in een detector (PMT of fotodiode) terechtkomt, zijn er drie kenmerken die kunnen worden geregistreerd: hoogte, breedte en oppervlakte. Terwijl het pulsgebied het meest wordt gemeld, zijn er duidelijke voor-en nadelen aan elk. Binnen verstrooiingsparameters, worden de plots van de impulshoogte versus impulsbreedte gebruikt om enige cellen te isoleren die door de cytometer gaan, en daardoor om het even welke niet-enige cellen (doublets, klontjes of puin) verwijderen.

Figuur 4. Afzonderlijke cellen onderscheiden van scatterhoogte versus scatterbreedte parameters in FlowJo™.

een flowcytometer meet FSC en SSC gelijktijdig, en de twee gecombineerde parameters bieden een vrij goede basis om analyse van een celpopulatie te beginnen. Er zijn verdere methodes van celkwantificatie, maar er is een groot deel van informatie die uit verspreidersgegevens kan worden verkregen.

  1. Shapiro, Howard. Praktische Cytometry Stroom. New York, Alan R. Liss, 1985.

  2. schematisch overzicht van een typische flow cytometer setup. 2016, SelectScience.

Geef een antwoord

Het e-mailadres wordt niet gepubliceerd.