Scatter înainte vs.Scatter lateral

citometria în flux este o metodă de analiză cu o singură celulă care include caracterizarea proprietăților fizice ale unei celule. Într-un Citometru de flux, o populație de celule este suspendată într-o soluție salină limpede. Suspensia este canalizată printr-o duză care creează un flux unicelular. Populația trece apoi pe lângă un set de surse de lumină laser, câte o celulă la un moment dat. În timp ce este interogat de lasere, celula împrăștie lumina (1). Figura 1 oferă o imagine de ansamblu a unei scheme a citometrului de flux.

Sistem Optic.PNG

Figura 1. Schema optică a citometrului de flux (2).

raportul dintre dimensiunea celulei și lungimea de undă a laserului modifică comportamentul de împrăștiere. Când dimensiunea celulei este mai mică decât excitația laserului interogator, comportamentul de împrăștiere este inconsistent și de intensitate redusă. În consecință, laserul emite de obicei lumină la o lungime de undă mai scurtă decât particulele interogate. O lungime de undă de 488 sau 405 nm este comună (1).

dispersia luminii este măsurată de doi detectori optici. Un detector măsoară împrăștierea de-a lungul căii laserului (1). Acest parametru este denumit scatter înainte (FSC). Celălalt detector măsoară împrăștierea la un unghi de nouăzeci de grade față de laser (1). Acest parametru se numește scatter lateral (SSC). Atunci când sunt măsurate împreună, aceste două măsurători permit un anumit grad de diferențiere celulară în cadrul unei populații eterogene.

măsurarea împrăștierii înainte permite discriminarea celulelor în funcție de dimensiune. Intensitatea FSC este proporțională cu diametrul celulei și se datorează în primul rând difracției luminii în jurul celulei. Împrăștierea înainte este detectată de o fotodiodă, care transformă lumina într-un semnal electric. Intensitatea tensiunii produse este proporțională cu diametrul celulei interogate (1).

FSC este util pentru a distinge între celulele sistemului imunitar. Monocitele și limfocitele sunt două clase de celule albe din sânge. În general, monocitele sunt mai mari decât limfocitele și prezintă o împrăștiere înainte de o intensitate mai mare.

Figura 2. Discriminarea limfocitelor și monocitelor în flowjo-uri pe baza parametrilor de dispersie. Notă: Acest exemplu are doar scop ilustrativ, populațiile ilustrate fie nu sunt celule monocitare/limfocite reale, fie pacientul prezintă monocitoză acută.

măsurarea dispersiei laterale oferă informații despre complexitatea internă (adică granularitatea) unei celule. Interfața dintre laser și structurile intracelulare determină refracția sau reflectarea luminii. Componentele celulare care cresc dispersia laterală includ granulele și nucleul (1).

în raport cu dispersia înainte, semnalele luminoase de la dispersia laterală sunt slabe. Un tub fotomultiplicator (PMT) este utilizat pentru a măsura dispersia laterală, deoarece este un detector optic mai sensibil (1).

dispersia laterală este utilă pentru identificarea celulelor cu complexitate variabilă. De exemplu, monocite și granulocite. Granulocitele se caracterizează prin volumul mare de granule citoplasmatice. Reflexia luminii de pe granule crește intensitatea măsurării SSC și permite discernământul între granulocite și monocite (1).

Figura 3. Discriminarea granulocitelor și monocitelor în FlowJo pe baza parametrilor de împrăștiere.

pentru fiecare semnal (adică puls electromagnetic) care trece într-un detector (PMT sau fotodiodă) există trei caracteristici care pot fi înregistrate: înălțime, lățime și suprafață. În timp ce zona pulsului este cel mai frecvent raportată, există avantaje și dezavantaje distincte pentru fiecare. În cadrul parametrilor de împrăștiere, parcelele înălțimea impulsului față de lățimea impulsului sunt utilizate pentru a izola celulele unice care trec prin Citometru și, prin urmare, pentru a îndepărta orice celule non-unice (dublete, aglomerări sau resturi).

Figura 4. Discriminarea celulelor unice de la înălțimea scatter față de parametrii lățime scatter în flowjo XV.

un Citometru de flux măsoară FSC și SSC concomitent, iar cei doi parametri combinați oferă o bază destul de bună pentru a începe analiza unei populații de celule. Există și alte metode de cuantificare a celulelor, dar există o mulțime de informații care pot fi obținute din datele scatter.

  1. Shapiro, Howard. Citometrie Practică În Flux. New York, Alan R. Liss, 1985.

  2. prezentare schematică a unei configurații tipice a citometrului de flux. 2016, Selectațiștiință.

Lasă un răspuns

Adresa ta de email nu va fi publicată.